環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop?Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是一類等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，區(qū)別于傳統(tǒng)PCR需要反復(fù)升降溫的熱循環(huán)模式，整套擴(kuò)增過程維持在恒定溫度區(qū)間完成，依托特異性引物與鏈置換聚合酶實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)基因的擴(kuò)增檢測(cè)?；騆AMP試劑盒將反應(yīng)所需的酶、緩沖組分、底物等進(jìn)行預(yù)配制，降低試劑配制門檻，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作流程，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)、基層樣本篩查、科研樣本分析等場(chǎng)景得到較多應(yīng)用。
LAMP技術(shù)基礎(chǔ)原理
LAMP技術(shù)依靠4?6條特異性引物，識(shí)別靶基因上6?8段不同核酸序列，搭配具備鏈置換活性的Bst DNA聚合酶開展擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)溫度通常穩(wěn)定在60?65℃區(qū)間，無(wú)需熱循環(huán)儀完成變性?退火?延伸循環(huán)。
基礎(chǔ)引物包含兩對(duì)核心引物：外引物F3、B3，內(nèi)引物FIP、BIP；增加環(huán)引物FLP、BLP可以增加擴(kuò)增起始位點(diǎn)，縮短整體反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)。反應(yīng)啟動(dòng)后，引物與模板結(jié)合，聚合酶持續(xù)合成新鏈并置換下游雙鏈，逐步生成啞鈴狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA中間體，進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)，最終產(chǎn)生大量具有多莖環(huán)特征的擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)過程會(huì)生成焦磷酸鎂白色沉淀，可結(jié)合濁度、pH指示劑、熒光染料實(shí)現(xiàn)結(jié)果判讀，RNA樣本可通過RT?LAMP體系，加入逆轉(zhuǎn)錄組分完成RNA到cDNA的轉(zhuǎn)換后同步擴(kuò)增。
基因LAMP試劑盒核心組分
商品化LAMP試劑盒一般分為預(yù)混主反應(yīng)液、功能酶、引物體系、質(zhì)控參考品幾大部分，不同廠商配方會(huì)存在差異。
LAMP主反應(yīng)預(yù)混液：包含反應(yīng)緩沖體系、鎂離子、dNTP底物、甜菜堿、穩(wěn)定劑等，部分試劑盒內(nèi)置可視化顯色染料，可直接肉眼觀察顏色變化，無(wú)需開蓋電泳；部分版本加入dUTP與UDG酶體系，用于緩解擴(kuò)增產(chǎn)物攜帶污染帶來(lái)的假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。鎂離子濃度、甜菜堿含量會(huì)直接影響引物退火效率與鏈置換效率，是配方優(yōu)化的重點(diǎn)參數(shù)。
鏈置換聚合酶：主流采用Bst DNA聚合酶大片段，該酶具備鏈置換合成活性，適配等溫反應(yīng)條件；RT?LAMP試劑盒還會(huì)配套逆轉(zhuǎn)錄酶，支持RNA靶標(biāo)檢測(cè)，部分改良型熱啟動(dòng)酶可以降低非特異性擴(kuò)增發(fā)生概率。
特異性引物組：試劑盒分為通用試劑盒與靶標(biāo)定制試劑盒，通用試劑盒僅提供引物稀釋體系，需要使用者自行設(shè)計(jì)合成靶標(biāo)引物；定制試劑盒會(huì)預(yù)配對(duì)應(yīng)靶基因的全套引物。引物設(shè)計(jì)對(duì)LAMP實(shí)驗(yàn)成敗影響較大，需要兼顧靶序列保守性、GC占比，減少引物二聚體與二級(jí)結(jié)構(gòu)干擾，加入環(huán)引物有助于縮短反應(yīng)時(shí)間。
質(zhì)控對(duì)照品：包含陽(yáng)性對(duì)照模板與陰性對(duì)照，用于評(píng)估試劑有效性，判斷實(shí)驗(yàn)體系是否存在污染，每批次實(shí)驗(yàn)建議同步設(shè)置對(duì)照反應(yīng)，保障結(jié)果可信。
試劑盒實(shí)驗(yàn)流程與結(jié)果判讀
常規(guī)LAMP試劑盒操作流程相對(duì)簡(jiǎn)潔，多數(shù)采用單管反應(yīng)模式：將試劑盒主預(yù)混液、聚合酶、引物、待測(cè)樣本模板按體系配比混合，置于金屬浴、水浴等恒溫設(shè)備，60?65℃保溫20?60分鐘，之后可升溫終止反應(yīng)。樣本可以為純化核酸，部分免提取試劑盒允許直接使用粗裂解樣本，進(jìn)一步縮減前處理步驟。
結(jié)果判讀有多種可選方式：
可視化顯色法：依靠染料顏色變化或體系濁度改變，肉眼直接完成初篩，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；
熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)：借助熒光設(shè)備記錄擴(kuò)增過程熒光信號(hào)變化，記錄反應(yīng)起峰時(shí)間，便于半定量分析；
凝膠電泳驗(yàn)證：擴(kuò)增產(chǎn)物電泳會(huì)出現(xiàn)特征性階梯狀條帶，該方式需要開蓋操作，存在氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)，需要在獨(dú)立區(qū)域開展實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)過程中，陽(yáng)性對(duì)照正常擴(kuò)增、陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果才具備參考意義；若陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，提示體系存在核酸污染，需要排查操作環(huán)境、耗材與試劑情況。
LAMP試劑盒技術(shù)特點(diǎn)
相較于傳統(tǒng)PCR體系，LAMP試劑盒具備多方面適配現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的特性。反應(yīng)只需要恒定溫度，不需要PCR熱循環(huán)儀，設(shè)備門檻較低；擴(kuò)增周期較短，多數(shù)樣本可在一小時(shí)以內(nèi)完成檢測(cè)；多引物識(shí)別靶基因多個(gè)序列，對(duì)靶標(biāo)序列識(shí)別具備多重約束；部分配方對(duì)樣本中少量抑制物耐受能力較好，對(duì)樣本前處理要求可以適度放寬。
同時(shí)該技術(shù)也存在客觀局限。引物設(shè)計(jì)難度高于普通PCR，靶標(biāo)序列的長(zhǎng)度、堿基組成會(huì)直接影響擴(kuò)增效果；擴(kuò)增效率較高，氣溶膠帶來(lái)的產(chǎn)物污染風(fēng)險(xiǎn)相較PCR更為突出，操作中需要嚴(yán)格區(qū)分試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)；傳統(tǒng)LAMP體系實(shí)現(xiàn)單管多靶標(biāo)并行檢測(cè)存在一定難度；顯色法容易受引物二聚體、非特異擴(kuò)增干擾，帶來(lái)假陽(yáng)性信號(hào)，需要配合對(duì)照體系綜合判斷結(jié)果。
主要應(yīng)用場(chǎng)景
病原微生物檢測(cè)：細(xì)菌、病毒、真菌等病原體核酸篩查，在獸醫(yī)檢測(cè)、食品微生物污染篩查、基層樣本快速初篩領(lǐng)域應(yīng)用較多，部分RT?LAMP試劑盒用于RNA類病原體檢測(cè)。
動(dòng)植物基因檢測(cè)：作物轉(zhuǎn)基因成分鑒定、物種鑒別、植物病害病原篩查，野外田間樣本可搭配簡(jiǎn)易恒溫設(shè)備開展現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
科研基礎(chǔ)研究：基因定性篩查、樣本批量初篩，為后續(xù)測(cè)序、PCR驗(yàn)證提供前置篩選依據(jù)。
POCT即時(shí)檢測(cè)方向：試劑盒結(jié)合微流控、試紙條等載體，向一體化快速檢測(cè)方向拓展，適配資源條件有限的檢測(cè)環(huán)境。
使用關(guān)鍵注意事項(xiàng)
防污染管理：LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物拷貝數(shù)高，氣溶膠容易造成交叉污染。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格分區(qū)，盡量選擇閉管檢測(cè)方案，減少開蓋操作；可選用帶UDG防污染體系的試劑盒，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面開展核酸污染排查。
引物與體系優(yōu)化：使用通用試劑盒時(shí)，引物設(shè)計(jì)質(zhì)量直接決定實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)，需要評(píng)估靶標(biāo)保守區(qū)域，測(cè)試不同引物配比、鎂離子濃度，優(yōu)化反應(yīng)條件。
樣本質(zhì)量控制：粗樣本體系雖有一定抗抑制能力，高濃度雜質(zhì)依然會(huì)抑制擴(kuò)增，需要根據(jù)試劑盒說(shuō)明控制樣本上樣量。
結(jié)果綜合判定：可視化顯色僅作為初篩依據(jù)，可疑樣本建議結(jié)合其他核酸檢測(cè)手段復(fù)核；不可單獨(dú)依靠單一顯色結(jié)果作為最終判定依據(jù)。
試劑儲(chǔ)存：多數(shù)試劑盒組分需要?20℃避光保存，避免反復(fù)凍融；凍干型試劑盒儲(chǔ)存條件相對(duì)寬松，需遵循產(chǎn)品說(shuō)明書要求。
技術(shù)發(fā)展展望
隨著酶工程、染料體系、防污染工藝迭代，LAMP試劑盒在特異性、抗干擾能力上持續(xù)優(yōu)化。將LAMP與CRISPR、免疫層析試紙、微流控芯片結(jié)合，能夠兼顧等溫?cái)U(kuò)增的便捷性與結(jié)果識(shí)別的準(zhǔn)確性，降低非特異信號(hào)干擾，推動(dòng)更多一體化快速檢測(cè)方案落地。同時(shí)探針型LAMP體系逐步發(fā)展，在一定程度上改善傳統(tǒng)LAMP不易實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)檢測(cè)的短板，拓展試劑盒的應(yīng)用邊界。
結(jié)語(yǔ)
基因LAMP試劑盒憑借等溫?cái)U(kuò)增、設(shè)備門檻低、檢測(cè)速度較快的特點(diǎn)，成為核酸檢測(cè)體系中重要的技術(shù)補(bǔ)充。它并不能替代qPCR等檢測(cè)手段，在實(shí)際使用中需要充分認(rèn)識(shí)其優(yōu)勢(shì)與固有局限，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，完善對(duì)照設(shè)置，結(jié)合應(yīng)用場(chǎng)景合理選擇，從而獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。
